0800 211 530 бесплатно в пределах Украины
Украина, г. Одесса, Воронцовский п. 8
Cвязаться с нами

Васколострумальные клетки из фолликулов волос человека

Стволовые клетки из фолликулов волос человека: первая механическая изоляция для немедленного аутологичного клинического использования при андрогенной алопеции и выпадении волос.

Аннотация

Волосяные фолликулы, как известно, содержат хорошо охарактеризованную нишу для взрослых стволовых клеток: выпуклость, которая содержит эпителиальные и меланоцитарные стволовые клетки. Стволовые клетки в выпуклости волос, четко демаркационная структура в нижней постоянной части волосяных фолликулов, может генерировать межфолликулярный эпидермис, структуры волосяных фолликулов и сальные железы. Эпителиальные стволовые клетки выпуклости могут также восстанавливаться в искусственной системе in vivo в новый волосяной фолликул. В этом исследовании мы разработали новый метод выделения человеческих взрослых стволовых клеток путем механического центрифугирования биопсии пуансона из человеческих волосяных фолликулов без культуры. Мы показали, что выделенные клетки способны улучшить плотность волос у пациентов, страдающих андрогенной алопецией (АГА). Эти клетки, по-видимому, расположены в области выпуклости человеческих волосяных фолликулов.

Введение

Восемьдесят процентов европейских мужчин имеют некоторую степень андрогенной алопеции (АГА) в возрасте до 70. В настоящее время законные методы лечения АГА включают в себя настерид, миноксидил и трансплантацию волос. Роль плазмы, богатой тромбоцитами, была продемонстрирована в последних докладах.

При АГА миниатюризация фолликула сопровождается уменьшением анагена, с увеличением процента спящих (телогенных) волосяных фолликулов, содержащих микроскопические волосы в лысине. В дополнение к этим внутренним изменениям в волосяном фолликуле, вокруг миниатюризирующего фолликула были обнаружены лифтинг-лимфоциты и тучные клетки, особенно в области выпуклости, богатой стволовыми клетками. В лысеющей коже головы количество стволовых клеток волосяных фолликулов (HFSC) остается неизменным, тогда как число более активно пролиферирующих клеток-предшественников заметно уменьшается. Это говорит о том, что лысеющая кожа головы не имеет активатора или имеет ингибитор роста волосяных фолликулов.

Здесь мы использовали стволовые клетки волосяных фолликулов, полученные механическим центрифугированием биопсии пуансона кожи головы, для улучшения плотности волос у 11 пациентов (от 38 до 61 года), болеющих АГА.

Протокол исследования соответствовал Хельсинской декларации, европейским нормам, и все пациенты дали письменное информированное согласие на участие в исследовании.

Текущие правила

Чтобы понять смысл существующих европейских правил, необходимо различать «минимальные манипуляции» и передовую клеточную терапию, проводимую «обширной манипуляцией», которая включает сложные методы биообработки терапевтических клеток.

Ссылка делается на Правила n.1394 / 2007 Европейского парламента (ЕС) и Совета 13 ноября 2007 года о лекарственных средствах для современных методов лечения, где дается определение «продуктов биопроцессорной техники». Здесь конкретно говорится, что это определение исключает те продукты, которые содержат или сделаны исключительно из клеток и нежизнеспособных тканей человека или животных и которые не обладают фармакологическим, иммунологическим или метаболическим действием. В число передовых терапевтических фармацевтических продуктов, которые используются для генной и соматической клеточной терапии [Директива 2001/83 / (ЕС), Европейское сообщество, приложение I]. Клетки и ткани должны рассматриваться как продукты биопроцессорной инженерии, если они подвергаются «значительным манипуляциям».

Это же правило определяет разницу между обширными и минимальными манипуляциями и списками, которые считаются релевантными или нет.

Манипуляции, которые не считаются «биопроцессорной инженерией», это: резка, шлифовка, формование, стерилизация, центрифугирование, вымачивание в антибиотических или противомикробных растворах, стерилизация, облучение, разделение, концентрация или очистка, фильтрация, лиофилизация, замораживание, криоконсервация и нитрификация.

Обширная манипуляция клетками и тканями представляет собой процесс, который может привести к активации клеток и / или стимуляции клеточной пролиферации, и они также считаются «сильно манипулируемыми» клетками, которые, хотя и не активируются или стимулируются для пролиферации, связаны с биоматериалами.

Все клетки, подвергшиеся манипуляции с их генами, считаются «широко манипулируемыми».

Согласно статье по утверждению классификации высокотехнологических лекарственных средств, 20 июня 2014 EMA / CAT / 600280/2010 Rev 1, Комитета Расширенной Терапии (CAT), линия 10 «Та же самая существенная функция для клеточной популяции означает, что клетки, удаленные из их первоначальной среды в организме человека, используются для поддержания исходной функции в той же анатомической или гистологической среде», авторы утверждают, что аутологичное использование в одноэтапной хирургии, минимальное манипулирование, монофункциональное использование, «используемое для той же важной функции у реципиента, что и у донора», манипулирование устройствами в асептических условиях — это условия, которые не требуют правил Надлежащей Производственной Практики для обработки, Хорошей Клинической Практики для клинического применения и утверждения Этического Комитета.

Методы

Пациенты

В этом исследовании участвовали пациенты мужского пола, которые имели АГА в 3-5 стадии, как было определено шкалой классификации Норвуда-Гамильтона. Дополнительные факторы исключения были установлены на основе системных и местных критериев. В частности, системные критерии исключения из исследования включали данные о сепсисе, иммуносупрессии и раке, а также использование фармакологической терапии, нацеленной на АГА (то есть финастерид, дутастерид или антиандрогены) в течение предыдущих 12 месяцев. Критерии локализованного исключения из исследования включали использование местных методов лечения АГА (то есть миноксидила, аналогов простагландина, ретиноидов или кортикостероидов) в течение предыдущих 12 месяцев и исключения по собственному желанию.

Диагнозы АГА были установлены на основе детального изучения истории болезни (т. е. скрининга лекарственных средств, связанных с выпадением волос), клинического обследования и трихоскопических признаков (т. е.> 20% изменчивости в диаметре волос между пораженными и непораженными областями). Ага была клинически диагностирована у пациентов при обнаружении увеличения миниатюризированных пушковых волос и / или уменьшение количества волос на физическом обследовании и фототрихограмме, наряду с отрицательными пул-тестом волос. Лабораторные тесты проводились для исключения альтернативных причин выпадения волос, таких как плохое питание, анемия, дисфункция щитовидной железы и сифилис. Анализ мочи был использован для выявления уровней 17-идрокортикостероида, 17-кетостероида, дегидроэпиандростерона, свободного кортизола, прегнантриола и тестостерона у всех участников исследования. Наконец, для всех участников были измерены уровни циркуляции кортизола, дигидротестостерона, дегидроэпиандростерон, D4-андростендиона, 17-гидроксипрогестерона, 3-α-диола глюкуронида, пролактина и гонадотропинов.

Процедура приготовления аутологичной суспензии волосяного фолликула человека и подготовка.

Аутологичная суспензия стволовых клеток волосяного фолликула для немедленного клинического применения была подготовлена с использованием инновационного медицинского устройства под названием Rеgeneracons (сертифицированный CE класс I, HBW srl; Турин, 115 Италия) (рис. 1A, B). После извлечения тканей скальпа во время биопсии пуансона (рис. 1С) авторы режут извлеченные ткани на полоски (2 мм × 2 мм) (рис. 1D), устраняя избыточную жировую ткань. Полоски осторожно собрали и дезагрегировали в стерильных условиях (вертикальный ламинарный потолочный капюшон) Rigeneracons (рис. 2A, B) в 1,2 мл физиологического раствора [NaCl 0,9% (мЕ / мл: Na + 0,154, Cl-0,154); MOsm / L 308, pH 4,5-7,0] (фиг. 2C). После 60-секундного центрифугирования при 80 об / мин (рис. 2D) клеточная суспензия была собрана из системы (фиг. 3А, В) и механически инфильтрирована в кожу головы пациентов, страдающих АГА (рис. 3C, D). Кроме того, полученную клеточную суспензию культивировали и затем характеризовали с помощью цитоспина и иммуноцитохимии для идентификации стволовых клеток волосяного фолликула.

Цель состояла в том, чтобы дезагрегировать небольшой кусочек ткани кожи головы и своевременно выбрать популяцию клеток размером 50 мкм.

Рисунок 1 Процедура Regenera 1-я фаза (биопсия пуансона и резка тканей скальпелем). (A) устройство Rеgenera Securdrill; (B) комплект Rеgeneracons; (C) извлечение тканей скальпа во время биопсии пуансона; (D) авторы режут ткани скальпа на полоски (2 мм × 2 мм).
Протокол процедуры приготовления аутологичной суспензии волосяного фолликула человека и ее введение.

Для каждого пациента скальп, пораженный выпадением волос, был разделен на четыре области (лобная, теменная, темя и затылочная); Местная анестезия не вводилась в обработанные участки. Внутримышечные инъекции фолликулярных стволовых клеток (0,2 мл • см2) вводили в выбранные области скальпа на глубину 5 мм с использованием пистолета-распылителя Ultim (Anti-Aging Medical Systems, Montrodat, Франция), оснащенного 30-калибрами (рисунок 3D ), 1 мл люэровским шприцом во время двух сессий, с разницей в 60 дней.
У пациентов с выпадением волос, локализованных в лобной и теменной областях, инъекции стволовых клеток волосяного фолликула были введены исключительно в лобную зону головы, а инъекции плацебо (то есть физиологический раствор) вводились в теменных областях. Аналогично, для пациентов с потерей волос, ограниченной теменной и областью и теменем, стволовые клетки волосяного фолликула вводили в теменную область, и плацебо вводили в темя. Были сделаны эквивалентные количества инъекций аутологичных стволовых клеток волосяного фолликула и инъекций плацебо.

Оценка роста волос и клиническая оценки

Все пациенты оценивались в четыре этапа: T0, начало исследования (рисунок 4A); T1 через 3 недели (фиг. 4B); T2, через 9 недель (фиг. 4C); T3, через 16 недель и T4 через 23 недели после последнего лечения (рисунок 4D). Рост волос, оцененный после последнего лечения, сравнивался фотографически с базовой оценкой, полученной перед обработкой, и между областью лечения стволовыми клетками волосяных фолликулов и контрольной областью, которая получала инъекции плацебо. Фотографии областей скальпа, обработанного стволовыми клетками волосяного фолликула, показаны на рисунках 3C, 5A. Влияние стволовых клеток волосяных фолликулов и лечение плацебо на рост волос оценивали у всех пациентов с помощью общей фотографии (рис. 5B), шкалы оценки врача и пациента. У всех пациентов, две поступательные области выпадения волос, одна по границе лечимой половины и вторая по границе половины, где использовалось плацебо, были разграничены временной татуировкой.

Рисунок 2 Процедура Regenera фаза 2 (помещение ткани скальпа в Rеgeneracons и центрифугирование). (A) Полоски, собранные в Rеgeneracons; (B) деталь Rеgeneracons, содержащая одну полоску; (C) добавление 1,2 мл физиологического раствора; (D) центрифугирование при 80 об/мин устройством Rеgenera Securdrill в течение 60 секунд.

Процедуры цитоспина и иммуноцитохимии.
Одиннадцать образцов суспензии стволовых клеток фолликулов были проанализированы в Институте анатомической патологии Университета Тор Вергата. Суспензии тканей скальпа, фиксированные 4% параформальдегидом, характеризовались маркерами мезенхимальных и эпителиальных стволовых клеток, такими как CD44 и CD200, соответственно. После клеточной адгезии на стеклянном слайде цитоспином иммуноцитохимия проводилась с определенными первичными антителами (CD44 sc-9960, 1:10, CD200 ab203887, 1: 100).

Результаты

Основными результатами были микроскопическая идентификация и подсчет стволовых клеток волосяных фолликулов. Вторичными результатами были клинические предварительные результаты и безопасность и техническая осуществимость обработки кожи головы стволовыми клетками волосяных фолликулов.
Микроскопическая идентификация и подсчет стволовых клеток волосяного фолликула
каждая суспензия ткани кожи головы содержала около 3,728.5 ± 664,5 клеток. Процент полученных фолликулярных мезенхимальных стволовых клеток CD44 + [из дермального сосочка] составлял около 196 5% + 0,7% (рис. 6A), тогда как процент эпителиальных стволовых клеток CD200 + (из выпуклости) составлял около 2,6% + 0,3% (рис. 6В). Положительные клетки подсчитывали в общей площади под световым микроскопом с увеличением 400 × (Eclipse E600, Nikon, Япония) и при помощи микрофотографий, снятыми цифровой камерой DXM1200F (Nikon) с использованием программного обеспечения ACT-1 (Nikon). Оставшиеся клетки в основном представлены S100 + дермальными фибробластами (> 85%), а эпидермальные клетки (эпителиальные клетки и меланоциты <10%) распознаются по их характерным морфологическим аспектам (данные не показаны).

Рисунок 3 Процедура Regenera фаза 3 (клеточная суспензия, содержащаяся в Rеgeneracons и инфильтрация). (A) клеточная суспензия, полученная системой, содержащейся в Rеgeneracons; (B) сбор клеточной суспензии; (C) выбранная область обработанной кожи головы; (D) механическая и контролируемая инфильтрация, выполняемая Ultim Gun.

Клинические результаты

В общей сложности через 23 недели после последнего лечения стволовыми клетками волосяного фолликула количество волос и плотность волос увеличиваются (рисунок 4D) по сравнению с исходными значениями (рисунок 4A). В частности, увеличилась плотность волос на обработанной площади на 29% ± 5% и уменьшилась плотности волос в плацебо на 1%. В исходном уровне статистические различия в количестве или плотности волос между областью лечения стволовыми клетками волосяных фолликулов и контрольной зоной кожи головы отсутствовали.
В этом предварительном отчете мы показали клинический эффект инъекции суспензии ткани головы. Однако мы предполагаем, что стволовые клетки могут улучшить образование новых фолликулов, но эта гипотеза должна быть продемонстрирована в следующем исследовании.

Обсуждение

Восстановление полностью организованного и функционального волосяного фолликула из диссоциированных клеток, размножающихся в определенных условиях тканевой культуры, представляет собой проблему, которая еще не решена в тканевой инженерии. Также существует большой интерес к поиску различных стратегий, направленных на регенерацию или неогенерирование волосяного фолликула в условиях, характерных для взрослого человека. Основываясь на текущих знаниях об эпителиальных и дермальных клетках и их взаимодействиях во время генерации эмбриональных волос и циклах роста волос у взрослых, многие исследователи пытались получить зрелые фолликулы волос, используя различные стратегии и подходы в зависимости от причин выпадения волос.
В этом предварительном исследовании авторы разработали новый метод выделения человеческих взрослых стволовых клеток путем механического центрифугирования биопсии пуансона из фолликулов человеческого волоса без культуры и впервые сообщили, насколько нам известно, подсчет этих клеток и предварительные результаты, полученные с помощью инъекций человеческих стволовых клеток фолликула в кожу головы пациентов, страдающих АГА, улучшая плотность волос.
В частности, авторы сообщили о процентной доле волосяного фолликула мезенхимальных стволовых клеток CD44 +, полученных из дермального сосочка и процент эпителиальных стволовых клеток CD200 + волосяного фолликула из выпуклости.
В настоящее время авторы считают необходимым обсудить, как следует, текущие достижения в различных экспериментальных стратегиях для регенерации или неогенерирования волосяных фолликулов с упором на те, которые связаны с регенерацией волосяных фолликулов у взрослых людей с использованием изолированных клеток и тканевой инженерии. Большинство из этих экспериментов проводили с использованием клеток грызунов, в частности эмбрионального или новорожденного происхождения. Однако пока не сообщается о успешной стратегии создания человеческих волосяных фолликулов из взрослых клеток. Возможно, самой важной задачей является предоставление трехмерных условий культуры, имитирующих структуру живых тканей. Улучшение условий культивирования, которые позволяют расширять конкретные клетки при защите их индуктивных свойств, а также методы отбора популяций эпителиальных стволовых клеток, должны дать нам необходимые инструменты для преодоления трудностей, которые ограничивают регенерацию фолликулов волосяного покрова.
Эти клетки, по-видимому, расположены в области выпуклости человеческих волосяных фолликулов. Известно, что фолликулы волос содержат хорошо охарактеризованную нишу для взрослых стволовых клеток: выпуклость, которая содержит эпителиальные и меланоцитарные стволовые клетки. Стволовые клетки в выпуклости волос, четко демаркационная структура в нижней постоянной части волосяных фолликулов, может генерировать межфолликулярный эпидермис, структуры волосяных фолликулов и сальные железы. Эпителиальные стволовые клетки выпуклости могут также восстанавливаться в искусственной системе in vivo в новый волосяной фолликул.
Исследование, опубликованное Йу и другими впервые показали, что человеческие волосяные фолликулы также содержат популяцию стволовых клеток, которая может быть дифференцирована в нейрон, клетку гладкой мускулатуры и линии меланоцитов в индукционной среде. Кроме того, их данные показывают, что Oct4-позитивные клетки присутствуют в коже человека, и большинство из них расположены в волосяных фолликулах in vivo. Oct4 относится к семейству факторов транскрипции домена POU, которые обычно экспрессируются в плюрипотентных клетках развивающегося эмбриона и опосредуют плюрипотентность.
Возможно, что эти Oct4-позитивные клетки в волосяных фолликулах связаны с этими плюрипотентными стволовыми клетками, которые могут заметно вызывать рост фолликулярных меланобластов, клеток Меркель и других клетки. Эти стволовые клетки могут генерировать разнообразные типы клеток во время обновления или восстановления тканей в ответ на системные сигналы.
Больше исследований рекомендованы для дальнейшего описания этих стволовых клеток в волосяных фолликулах. Выпуклость волос — ниша стволовых клеток, которая может быть выделена окрашиванием K15. Опять же, Йу и другие продемонстрировали, что большинство Oct4-позитивных клеток в коже человека расположены в областях, выделенных окрашиванием K15 in vivo, что указывает на то, что эти стволовые клетки расположены в области выпуклости, область, которая обеспечивает уникальную среду, ограниченную дифференциацией для взрослых стволовых клеток. В заключение, их данные показывают, что человеческие волосяные фолликулы содержат мультипотентные стволовые клетки, отличные от эпителиальных и меланоцитарных стволовых клеток, и эти клетки расположены в области выпуклости. Эти клетки демонстрируют многообещающую пластичность в условиях ex vivo и in vitro, что делает их потенциальными кандидатами на клеточную инженерию и клетозаменную терапию.

Человеческие ткани скальпа легко доступны, и тот факт, что сферы волос могут быть получены из аутологичной ткани взрослого человека, делает ее привлекательным источником индивидуальной терапии на основе клеток.
Каждый зрелый волосяной фолликул представляет собой регенерирующую систему, которая физиологически подвергается циклам роста (анаген), регрессии (катагена) и отдыха (телогена) много раз во взрослой жизни. В катагене стволовые клетки волосяного фолликула поддерживаются в выпуклости. Затем остаточный фолликул возвращается в анаген (регенерация), когда предусмотрены соответствующие молекулярные сигналы. Во время позднего телогена до раннего анагенного перехода сигналы от дермальных сосочков стимулируют зародышеобразование и стволовые клетки выпуклости в состоянии покоя активируются. В анагене стволовые клетки в выпуклости приводят к появлению зародышей волос, затем переходные усиливающие клетки в матрице нового фолликула быстро размножаются, образуя новую волосяную нить.
Однако динамика клеток в этом процессе менее ясна, чем в физиологическом обновлении, и для понимания этого процесса необходимы дальнейшие исследования.
Когда клеточная ниша полностью утрачена, необходимо сформировать совершенно новый волосяной фолликул в процессе, называемом регенерацией волосяного фолликула.
Основываясь на знаниях об эпителиальных и дермальных клетках и их взаимодействиях, во время генерации эмбриональных волос и взрослого цикла волос, были разработаны различные экспериментальные подходы для регенерации волосяных фолликулов или генерации новых методом неогенеза. Эти попытки регенерации волос и неогенеза могут быть разделены на четыре категории: (I) реверсия патологической в- и / или вне-фолликулярной среды, например АГА; (II) регенерация полных волосяных фолликулов путем рекомбинации частей волосяного фолликула; (III) регенерация волосяных фолликулов при помощи изолированных клеток; и (IV) регенерация волосяных фолликулов тканевой инженерией.
Регенерация волосяных фолликулов также наблюдалась у людей при использовании ткани дермальной оболочки, что было достаточным для регенерации также структуры дермальных сосочков. После имплантации вискер дермальных сосочков был способен индуцировать регенерацию волосяного фолликула, сохраняя информацию для определения типа волос и размера фолликула.
Прививка дермально-индуктивной ткани ограничивалась тем фактом, что не было возможности генерировать больше фолликулов волоса, чем полученные из донорских тканей. Чтобы преодолеть это ограничение, были испытаны различные подходы и экспериментальные модели с использованием свежих или культивированных изолированных клеток как кожного, так и дермального / эпидермального происхождения. Большинство из них включали неонатальные и эмбриональные мышиные клетки.
В исследовании, опубликованном в 2015 году Баланья и другие, авторы подготовили в лаборатории дермально-эпидермальный заменитель кожи путем посева бесклеточной дермальной матрицы с помощью культивированных эпителиальных стволовых клеток фолликула волоса и клеток дермального сосочка (DPC), полученных из взрослого человеческого волоса. Эти конструкции были привиты в рану с полной толщиной, образованную на коже обнаженных мышей. Через четырнадцать дней в привитой области наблюдались гистологические структуры, напоминающие о различных стадиях эмбрионального развития волосяного фолликула. Эти структуры показали концентрические клеточные слои человеческого происхождения и выделяли k6hf, кератин, присутствующий в эпителиальных клетках сопутствующего слоя. Хотя наличие полностью зрелых волосяных фолликулов не наблюдалось, эти результаты показали, что как эпителиальные, так и дермальные культивируемые клетки из взрослого человеческого скальпа в дермальном каркасе были способны продуцировать структуры in vivo, которые повторяют развитие эмбриональных волос.
Анализ всех этих исследований может привести к выводу, что неогенез волосяного фолликула с использованием эпителиальных и дермальных клеток человека является очень сложной задачей, которая может потребовать особых культурных условий, каким-то образом воссоздавая нормальную или эмбриональную среду кожи и использование эмбриональных или неонатальных клеток.
Действительно, за более чем 50 лет, начиная с начала 60-х годов, был достигнут значительный прогресс, чтобы в апреле 2017 года, в котором, вопреки тому, что появилось в предыдущих исследованиях, мы сообщили о последнем клиническом продвижении в возможности использовать стволовые клетки фолликула человека, полученные механическим центрифугированием, в соответствии с европейскими правилами, без культуры или использования ферментов, для лечения АГА.

Выводы

Наши предварительные данные показывают, что инъекция препаратов стволовых клеток волосяных фолликулов оказывает положительное терапевтическое воздействие на мужскую андрогенную алопецию без серьезных побочных эффектов. Поэтому авторы рекомендуют будущее исследование, а клиническим испытаним следует включать больше данных об использовании стволовых клеток волосяного фолликула.
Конфликты интересов: у авторов нет конфликта интересов.
Этическое заявление: утверждение этического комитета не требуется, и письменное информированное согласие было получено от всех пациентов.

Рисунок 4. 45-летний мужчина, курильщик, страдающий андрогенной алопецией, классифицирован с АГА 3 степени по шкале Нордвуд-Гамильтон. (A) Предоперационная ситуация при T0 кожи головы с потерей волос, локализованной в теменной, верхней и во фронтальной областях; (B) послеоперационная ситуация на голове у T1 через 3 недели после последнего лечения; (C) послеоперационная ситуация скальпа при T2 через 9 недель; (D) послеоперационная ситуация на голове у T4 через 23 недели после последнего лечения с увеличением плотности волос.
Рисунок 5 Деталь верхней правой области пациента мужчины, страдающего андрогенной алопецией, классифицированым АГА 3 степени по шкале Нордвуд-Гамильтон. (A) Предоперационная ситуация при T0 скальпа с потерей волос, локализованная в правой верхней и лобной области, обозначенной синими линиями; (В) послеоперационная ситуация на скальпе в той же области при Т4 через 23 недели после последнего лечения с увеличением плотности волос.
Рисунок 6 Иммунофенотипическая характеристика стволовых клеток волосяного фолликула в суспензии ткани головы человека. Иммуноцитохимия для маркеров стволовых клеток CD44 и CD200. (A) мезенхимальные стволовые клетки, полученные из фолликула; (B) эпителиальные стволовые клетки волосяного фолликула. Оригинальное увеличение 400 ×.