Васколострумальні клітини з фолікулів волосся людини

Анотація

Волосяні фолікули, як відомо, містять добре охарактеризовану нішу для дорослих стовбурових клітин: опуклість, яка містить епітеліальні та меланоцитарні стовбурові клітини. Стовбурові клітини у опуклості волосся, чітко демаркаційна структура у нижній постійній частині волосяних фолікулів, може генерувати міжфолікулярний епідерміс, структури волосяних фолікулів та сальні залози. Епітеліальні стовбурові клітини опуклості можуть також відновлюватися в штучній системі in vivo у новий волосяний фолікул. У цьому дослідженні ми розробили новий метод виділення дорослих людських стовбурових клітин шляхом механічного центрифугування біопсії пуансону з людських волосяних фолікулів без культури. Ми показали, що виділені клітини здатні покращити щільність волосся у пацієнтів, які страждають на андрогенну алопецію (АГА). Ці клітини, мабуть, розташовані в ділянці опуклості людських волосяних фолікулів.

Вступ

Вісімдесят відсотків європейських чоловіків мають деякий ступінь андрогенної алопеції (АДА) у віці до 70. В даний час законні методи лікування АДА включають настерид, міноксидил і трансплантацію волосся. Роль плазми, багатої на тромбоцити, була продемонстрована в останніх доповідях.

При АГА мініатюризація фолікула супроводжується зменшенням анагену, зі збільшенням відсотка сплячих (телогенних) волосяних фолікулів, що містять мікроскопічне волосся в лисині. На додаток до цих внутрішніх змін у волосяному фолікулі, навколо мініатюризуючого фолікула були виявлені ліфтинг-лімфоцити та огрядні клітини, особливо в області опуклості, багатої на стовбурові клітини. У лисіючій шкірі голови кількість стовбурових клітин волосяних фолікулів (HFSC) залишається незмінною, тоді як число більш активно проліферуючих клітин-попередників помітно зменшується. Це говорить про те, що шкіра голови, що лисіє, не має активатора або має інгібітор росту волосяних фолікулів..

Тут ми використовували стовбурові клітини волосяних фолікулів, отримані механічним центрифугуванням біопсії пуансона шкіри голови, для покращення щільності волосся у 11 пацієнтів (від 38 до 61 року), які хворіють на АГА..

Протокол дослідження відповідав Гельсінській декларації, європейським нормам, і всі пацієнти дали письмову поінформовану згоду на участь у дослідженні.

Поточні правила

Щоб зрозуміти зміст існуючих європейських правил, необхідно розрізняти «мінімальні маніпуляції» та передову клітинну терапію, що проводиться «великою маніпуляцією», що включає складні методи біообробки терапевтичних клітин.

Посилання робиться на Правила n.1394/2007 Європейського парламенту (ЄС) та Ради 13 листопада 2007 року про лікарські засоби для сучасних методів лікування, де дається визначення «продуктів біопроцесорної техніки». Тут конкретно говориться, що це визначення виключає ті продукти, які містять або виготовлені виключно з клітин і нежиттєздатних тканин людини або тварин і які не мають фармакологічної, імунологічної або метаболічної дії. До числа передових терапевтичних фармацевтичних продуктів, які використовуються для генної та соматичної клітинної терапії [Директива 2001/83/(ЄС), Європейське співтовариство, додаток I]. Клітини та тканини повинні розглядатися як продукти біопроцесорної інженерії, якщо вони піддаються «значним маніпуляціям».

Це правило визначає різницю між великими і мінімальними маніпуляціями і списками, які вважаються релевантними чи ні .

Маніпуляції, які не вважаються «біопроцесорною інженерією», це: різання, шліфування, формування, стерилізація, центрифугування, вимочування в антибіотичних або протимікробних розчинах, стерилізація, опромінення, поділ, концентрація або очищення, фільтрація, ліофілізація, заморожування.

Обширна маніпуляція клітинами і тканинами є процесом, який може призвести до активації клітин та/або стимуляції клітинної проліферації, і вони також вважаються «сильно маніпульованими» клітинами, які, хоч і не активуються або стимулюються для проліферації, пов’язані з біоматеріалами.

Всі клітини, що зазнали маніпуляції з їхніми генами, вважаються широко маніпулюваними.

Згідно статті за твердженням класифікації високотехнологічних лікарських засобів, 20 червня 2014 р. EMA / CAT / 600280/2010 Rev 1, Комітету Розширеної Терапії (CAT), лінія 10 «Та сама істотна функція для клітинної популяції означає, що клітини, видалені з них в організмі людини, що використовуються для підтримки вихідної функції в тому ж анатомічному або гістологічному середовищі», автори стверджують, що аутологічне використання в одноетапній хірургії, мінімальне маніпулювання, монофункціональне використання, що «використовується для тієї ж важливої ​​функції у реципієнта, що й у донора», маніпулювання пристроями в асептичних умовах – це умови, які не вимагають правил Належної Виробничої Практики для обробки, Хорошої Клінічної Практики для клінічного застосування та затвердження Етичного Комітету.

Методи

Пацієнти

У цьому дослідженні брали участь пацієнти чоловічої статі, які мали АГА на 3-5 стадії, як було визначено шкалою класифікації Норвуда-Гамільтона. Додаткові фактори виключення були встановлені на основі системних та місцевих критеріїв. Зокрема, системні критерії виключення з дослідження включали дані про сепсис, імуносупресію та рак, а також використання фармакологічної терапії, націленої на АГА (тобто фінастерид, дутастерид або антиандрогени) протягом попередніх 12 місяців. Критерії локалізованого виключення з дослідження включали використання місцевих методів лікування АГА (тобто міноксидилу, аналогів простагландину, ретиноїдів або кортикостероїдів) протягом попередніх 12 місяців та виключення за власним бажанням.

Діагнози АГА були встановлені на основі детального вивчення історії хвороби (тобто скринінгу лікарських засобів, пов’язаних з випаданням волосся), клінічного обстеження та трихоскопічних ознак (тобто >20% мінливості в діаметрі волосся між ураженими та непораженими областями). Ага була клінічно діагностована у пацієнтів при виявленні збільшення мініатюризованого пушкового волосся та/або зменшення кількості волосся на фізичному обстеженні та фототрихограмі, поряд з негативним пул-тестом волосся. Лабораторні тести проводилися для виключення альтернативних причин випадання волосся, таких як погане харчування, анемія, дисфункція щитовидної залози та сифіліс. Аналіз сечі був використаний для виявлення рівнів 17-ідрокортикостероїду, 17-кетостероїду, дегідроепіандростерону, вільного кортизолу, прегнантріолу та тестостерону у всіх учасників дослідження. Нарешті, для всіх учасників були виміряні рівні циркуляції кортизолу, дигідротестостерону, дегідроепіандростерону, D4-андростендіону, 17-гідроксипрогестерону, 3-α-діолу глюкуроніду, пролактину та гонадотропінів.

Процедура приготування аутологічної суспензії волосяного фолікула людини та підготовка.

Аутологічна суспензія стовбурових клітин волосяного фолікула для негайного клінічного застосування була підготовлена ​​з використанням інноваційного медичного пристрою під назвою Regeneracons (сертифікований CE клас I, HBW srl; Турін, 115 Італія) (мал. 1A, B). Після вилучення тканин скальпу під час біопсії пуансону (мал 1С) автори ріжуть витягнуті тканини на смужки (2 мм × 2 мм) (мал. 1D), усуваючи надмірну жирову тканину. Смужки обережно зібрали та дезагрегували у стерильних умовах (вертикальний ламінарний стельовий каптур) Rigeneracons (мал. 2A, B) у 1,2 мл фізіологічного розчину [NaCl 0,9% (мЕ/мл: Na + 0,154, Cl-0,154); MOsm/L 308, pH 4,5-7,0] (мал. 2C). Після 60-секундного центрифугування при 80 об/хв (мал. 2D) клітинна суспензія була зібрана із системи (мал. 3А, В) і механічно інфільтрована в шкіру голови пацієнтів, які страждають на АГА (мал. 3C, D). Крім того, отриману клітинну суспензію культивували і потім характеризували за допомогою цитоспіну та імуноцитохімії для ідентифікації стовбурових клітин волосяного фолікула.

Ціль полягала в тому, щоб дезагрегувати невеликий шматочок тканини шкіри голови і своєчасно вибрати популяцію клітин розміром 50 мкм.

Для кожного пацієнта скальп, уражений випаданням волосся, був розділений на чотири області (лобова, тім’яна, тем’я та потилична); Місцева анестезія не вводилася до оброблених ділянок. Внутрішньом’язові ін’єкції фолікулярних стовбурових клітин (0,2 мл • см2) вводили у вибрані області скальпу на глибину 5 мм з використанням пістолета-розпилювача Ultim (Anti-Aging Medical Systems, Montrodat, Франція), оснащеного 30-калібрами (рисунок 3D мл люерівським шприцем під час двох сесій, з різницею у 60 днів.
У пацієнтів з випаданням волосся, локалізованого в лобовій та тім’яній областях, ін’єкції стовбурових клітин волосяного фолікула були введені виключно в лобову зону голови, а ін’єкції плацебо (тобто фізіологічний розчин) вводилися у тім’яних областях. Аналогічно, для пацієнтів з втратою волосся, обмеженою тім’яною і областю і тім’ям, стовбурові клітини волосяного фолікула вводили в тім’яну область, і вводили плацебо в тем’я. Були зроблені еквівалентні кількості ін’єкцій аутологічних стовбурових клітин волосяного фолікула та ін’єкцій плацебо.

Оцінка росту волосся та клінічна оцінка

Усі пацієнти оцінювалися у чотири етапи: T0, початок дослідження (малюнок 4A); T1 через 3 тижні (малюнок. 4B); T2 через 9 тижнів (малюнок 4C); T3 через 16 тижнів і T4 через 23 тижні після останнього лікування (малюнок 4D). Зростання волосся, оцінене після останнього лікування, порівнювалося фотографічно з базовою оцінкою, отриманою перед обробкою, і між областю лікування стовбуровими клітинами волосяних фолікулів і контрольною областю, яка отримувала ін’єкції плацебо. Фотографії областей скальпу, обробленого стовбуровими клітинами волосяного фолікула, показано на рисунках 3C, 5A. Вплив стовбурових клітин волосяних фолікулів та лікування плацебо на ріст волосся оцінювали у всіх пацієнтів за допомогою загальної фотографії (малюнок 5B), шкали оцінки лікаря та пацієнта. У всіх пацієнтів, дві поступальні області випадання волосся, одна по межі половини, що лікується, і друга по межі половини, де використовувалося плацебо, були розмежовані тимчасовим татуюванням.

Малюнок 2 Процедура Regenera фаза 2 (приміщення тканини скальпу в Regeneracons і центрифугування). (A) Смужки, зібрані в Regeneracons; (B) деталь Rеgeneracons, що містить одну смужку; (C) додавання 1,2 мл фізіологічного розчину; (D) центрифугування при 80 об/хв пристроєм Regenera Securdrill протягом 60 секунд.

Процедури цитоспіну та імуноцитохімії.
Одинадцять зразків суспензії стовбурових клітин фолікулів було проаналізовано в Інституті анатомічної патології Університету Тор Вергата. Суспензії тканин скальпу, фіксовані 4% параформальдегідом, характеризувалися маркерами мезенхімальних та епітеліальних стовбурових клітин, такими як CD44 та CD200, відповідно. Після клітинної адгезії на скляному слайді цитоспіном імуноцитохімія проводилася з певними первинними антитілами (CD44 sc-9960, 1:10, CD200 ab203887, 1: 100).

Результати

Основними результатами були мікроскопічна ідентифікація та підрахунок стовбурових клітин волосяних фолікулів. Вторинними результатами були клінічні попередні результати та безпека та технічна здійсненність обробки шкіри голови стовбуровими клітинами волосяних фолікулів.
Мікроскопічна ідентифікація та підрахунок стовбурових клітин волосяного фолікула
кожна суспензія тканини шкіри голови містила близько 3,728.5±664,5 клітин. Відсоток отриманих фолікулярних мезенхімальних стволових клітин CD44 + [з дермального сосочка] становив близько 196 5% + 0,7% (рис. 6A), тоді як відсоток епітеліальних стволових клітин CD200 + (з опуклості) становив близько 2,6% + 0, 3% (рис. 6В). Позитивні клітини підраховували в загальній площі під світловим мікроскопом зі збільшенням 400 × (Eclipse E600, Nikon, Японія) та за допомогою мікрофотографій, знятих цифровою камерою DXM1200F (Nikon) з використанням програмного забезпечення ACT-1 (Nikon). Клітини, що залишилися, в основному представлені S100 + дермальними фібробластами (> 85%), а епідермальні клітини (епітеліальні клітини і меланоцити < 10%) розпізнаються за їх характерними морфологічними аспектами (дані не показані).

Клінічні результати

Загалом через 23 тижні після останнього лікування стовбуровими клітинами волосяного фолікула кількість волосся та щільність волосся збільшуються (рисунок 4D) порівняно з вихідними значеннями (рисунок 4A). Зокрема, збільшилась щільність волосся на обробленій площі на 29% ± 5% та зменшилась щільність волосся у плацебо на 1%. У вихідному рівні статистичні відмінності у кількості або щільності волосся між областю лікування стовбуровими клітинами волосяних фолікулів та контрольною зоною шкіри голови були відсутні.
У цьому попередньому звіті показали клінічний ефект ін’єкції суспензії тканини голови. Однак ми припускаємо, що стовбурові клітини можуть покращити утворення нових фолікулів, але ця гіпотеза має бути продемонстрована у наступному дослідженні.

Обговорення

Відновлення повністю організованого та функціонального волосяного фолікула з дисоційованих клітин, що розмножуються в певних умовах тканинної культури, є проблемою, яка ще не вирішена в тканинній інженерії. Також існує великий інтерес до пошуку різних стратегій, спрямованих на регенерацію або неогенерування волосяного фолікула за умов, характерних для дорослої людини. Грунтуючись на поточних знаннях про епітеліальні та дермальні клітини та їх взаємодії під час генерації ембріонального волосся та цикли росту волосся у дорослих, багато дослідників намагалися отримати зрілі фолікули волосся, використовуючи різні стратегії та підходи залежно від причин випадання волосся.
У цьому попередньому дослідженні автори розробили новий метод виділення людських дорослих стовбурових клітин шляхом механічного центрифугування біопсії пуансону з фолікулів людського волосся без культури і вперше повідомили, наскільки нам відомо, підрахунок цих клітин і попередні результати, отримані за допомогою ін’єкцій людських стовбурових клітин пацієнтів, які страждають на АГА, покращує щільність волосся.
Зокрема, автори повідомили про відсоткову частку волосяного фолікула мезенхімальних стовбурових клітин CD44+, отриманих з дермального сосочка та відсоток епітеліальних стовбурових клітин CD200+ волосяного фолікула з опуклості.
В даний час автори вважають за необхідне обговорити, отже, поточні досягнення в різних експериментальних стратегіях для регенерації або неогенерування волосяних фолікулів з упором на ті, які пов’язані з регенерацією волосяних фолікулів у дорослих людей з використанням ізольованих клітин та тканинної інженерії. Більшість цих експериментів проводили з використанням клітин гризунів, зокрема ембріонального або новонародженого походження. Однак поки що не повідомляється про успішну стратегію створення людських волосяних фолікулів із дорослих клітин. Можливо, найважливішим завданням є надання тривимірних умов культури, що імітують структуру живих тканин. Поліпшення умов культивування, які дозволяють розширювати конкретні клітини при захисті їх індуктивних властивостей, а також методи відбору популяцій епітеліальних стовбурових клітин повинні дати нам необхідні інструменти для подолання труднощів, які обмежують регенерацію фолікулів волосяного покрову. Ці клітини, мабуть, розташовані в ділянці опуклості людських волосяних фолікулів. Відомо, що фолікули волосся містять добре охарактеризовану нішу для дорослих стовбурових клітин: опуклість, яка містить епітеліальні та меланоцитарні стовбурові клітини. Стовбурові клітини у опуклості волосся, чітко демаркаційна структура у нижній постійній частині волосяних фолікулів, може генерувати міжфолікулярний епідерміс, структури волосяних фолікулів та сальні залози. Епітеліальні стовбурові клітини опуклості можуть також відновлюватися в штучній системі in vivo у новий волосяний фолікул.
Дослідження, опубліковане Йу та іншими вперше показали, що людські волосяні фолікули також містять популяцію стовбурових клітин, яка може бути диференційована в нейрон, клітину гладкої мускулатури та лінії меланоцитів в індукційному середовищі. Крім того, їх дані показують, що Oct4-позитивні клітини присутні в шкірі людини, і більшість їх розташовані у волосяних фолікулах in vivo. Oct4 відноситься до сімейства факторів транскрипції домену POU, які зазвичай експресуються в плюрипотентних клітинах ембріона, що розвивається, і опосередковують плюрипотентність.
Можливо, що ці Oct4-позитивні клітини у волосяних фолікулах пов’язані з цими стовбуровими плюрипотентними клітинами, які можуть помітно викликати зростання фолікулярних меланобластів, клітин Меркель та інших клітин. Ці стовбурові клітини можуть генерувати різноманітні типи клітин під час відновлення чи відновлення тканин у відповідь системні сигнали.
Більше досліджень рекомендовано для подальшого опису цих стовбурових клітин у волосяних фолікулах. Випуклість волосся – ніша стовбурових клітин, яка може бути виділена фарбуванням K15. Знову ж таки, Йу та інші продемонстрували, що більшість Oct4-позитивних клітин у шкірі людини розташовані в областях, виділених фарбуванням K15 in vivo, що вказує на те, що ці стовбурові клітини розташовані в області опуклості, область, яка забезпечує унікальне середовище, обмежене диференціацією для дорослих стовбурових клітин. На закінчення, їх дані показують, що людські волосяні фолікули містять мультипотентні стовбурові клітини, відмінні від епітеліальних і меланоцитарних стовбурових клітин, і ці клітини розташовані в області опуклості. Ці клітини демонструють багатообіцяючу пластичність в умовах ex vivo та in vitro, що робить їх потенційними кандидатами на клітинну інженерію та клітозамінну терапію.

Людські тканини скальпу легко доступні, і той факт, що сфери волосся можуть бути отримані з аутологічної тканини дорослої людини, робить її привабливим джерелом індивідуальної терапії на основі клітин.
Кожен зрілий волосяний фолікул є регенеруючою системою, яка фізіологічно піддається циклам росту (анаген), регресії (катагену) та відпочинку (телогену) багато разів у дорослому житті. У катагені стовбурові клітини волосяного фолікула підтримуються у опуклості. Потім залишковий фолікул повертається в анаген (регенерація), коли передбачено відповідні молекулярні сигнали. Під час пізнього телогена до раннього анагенного переходу сигнали від дермальних сосочків стимулюють зародокутворення та стовбурові клітини опуклості у стані спокою активуються. В анагені стовбурові клітини у опуклості призводять до появи зародків волосся, потім перехідні клітини, що посилюють, в матриці нового фолікула швидко розмножуються, утворюючи нову волосяну нитку.
Однак динаміка клітин у цьому процесі менш зрозуміла, ніж у фізіологічному оновленні, і для розуміння цього процесу потрібні подальші дослідження.
Коли клітинна ніша повністю втрачена, необхідно сформувати новий волосяний фолікул у процесі, званому регенерацією волосяного фолікула.
Грунтуючись на знаннях про епітеліальні та дермальні клітини та їх взаємодії, під час генерації ембріонального волосся та дорослого циклу волосся, були розроблені різні експериментальні підходи для регенерації волосяних фолікулів або генерації нових методом неогенезу. Ці спроби регенерації волосся та неогенезу можуть бути розділені на чотири категорії: (I) реверсія патологічного в- та/або поза-фолікулярного середовища, наприклад АГА; (II) регенерація повних волосяних фолікулів шляхом рекомбінації частин волосяного фолікула; (III) регенерація волосяних фолікулів за допомогою ізольованих клітин; та (IV) регенерація волосяних фолікулів тканинною інженерією. Регенерація волосяних фолікулів також спостерігалася у людей при використанні тканини дермальної оболонки, що було достатнім для регенерації структури дермальних сосочків. Після імплантації віскер дермальних сосочків був здатний індукувати регенерацію волосяного фолікула, зберігаючи інформацію визначення типу волосся і розміру фолікула.
Щеплення дермально-індуктивної тканини обмежувалося тим, що не було можливості генерувати більше фолікулів волосся, ніж отримані з донорських тканин. Щоб подолати це обмеження, були випробувані різні підходи та експериментальні моделі з використанням свіжих або культивованих ізольованих клітин як шкірного, так і дермального/епідермального походження. Більшість із них включали неонатальні та ембріональні мишачі клітини.
У дослідженні, опублікованому в 2015 році Баланья та інші, автори підготували в лабораторії дермально-епідермальний замінник шкіри шляхом посіву безклітинної дермальної матриці за допомогою культивованих епітеліальних стовбурових клітин фолікула волосся і клітин дермального сосочка (DPC), отриманих людським. Ці конструкції були щеплені в рану з повною товщиною, утворену на шкірі оголених мишей. Через чотирнадцять днів у щепленій області спостерігалися гістологічні структури, що нагадують про різні стадії ембріонального розвитку волосяного фолікула. Ці структури показали концентричні клітинні шари людського походження та виділяли k6hf, кератин, присутній в епітеліальних клітинах супутнього шару. Хоча наявність повністю зрілих волосяних фолікулів не спостерігалося, ці результати показали, що як епітеліальні, так і дермальні клітини, що культивуються, з дорослого людського скальпу в дермальному каркасі були здатні продукувати структури in vivo, які повторюють розвиток ембріонального волосся.Аналіз усіх цих досліджень може призвести до висновку, що неогенез волосяного фолікула з використанням епітеліальних та дермальних клітин людини є дуже складним завданням, яке може вимагати особливих культурних умов, якимось чином відтворюючи нормальне чи ембріональне середовище шкіри та використання ембріональних чи неонатальних клітин.
Справді, за більш ніж 50 років, починаючи з початку 60-х років, було досягнуто значного прогресу, щоб у квітні 2017 року, в якому, попри те, що з’явилося в попередніх дослідженнях, ми повідомили про останній клінічний поступ у можливості використовувати стовбурові клітини фолікула людини, отримані механічним центрифугуванням, відповідно до європейських правил, без культури або використання ферментів для лікування АГА.

Висновки

Наші попередні дані показують, що ін’єкція препаратів стовбурових клітин волосяних фолікулів позитивно впливає на чоловічу андрогенну алопецію без серйозних побічних ефектів. Тому автори рекомендують майбутнє дослідження, а клінічним випробуванням слід включати більше даних про використання стовбурових клітин волосяного фолікула.
Конфлікти інтересів: автори не мають конфлікту інтересів.
Етична заява: затвердження етичного комітету не потрібно, і письмову поінформовану згоду було отримано від усіх пацієнтів.