0800 211 530 бесплатно в пределах Украины
Украина, г. Одесса, ул. Базарная, 27
Cвязаться с нами

Клиническая эффективность микро-трансплантатов

Новое медицинское устройство Regeneracons позволяет получить жизнеспособные микро-трансплантаты при помощи механической дезагрегации человеческих тканей. Высокая эффективность устройства Regeneracons®, для изготовления суспензии клеток-предшественников из различных тканей человека, с высоким процентом жизнеспособности.

Аннотация

Аутологичный трансплантат считается золотым стандартом трансплантационных материалов, тем не менее, этот подход все еще ограничен из-за небольшого количества ткани, которая может быть собрана, и из-за снижения жизнеспособности клеток, которые могут быть получены. Цель этого предварительного исследования состояла в том, чтобы продемонстрировать эффективность инновационного медицинского устройства под названием Regeneracons® (CE сертифицированный класс I), чтобы сделать аутогенные микро-трансплантаты немедленно доступными для использования в клинической практике. Кроме того, Regeneracons® является инструментом, способным создать микро-трансплантаты, обогащенные клетками предшественниками, которые поддерживают их регенеративный и дифференциативный потенциал. Мы привели предварительные данные о жизнеспособности клеток в пробах, полученных из различных видов тканей человека, таких как надкостница, биопсия сердечного предсердия и прямой мышцы глазного яблока, дезагрегированных при помощи Regeneracons®. Во всех случаях мы наблюдали, что микро-трансплантаты, полученные Regeneracons® проявили высокую жизнеспособность клеток. Кроме того, с помощью клеточной характеристики образцов надкостницы, мы также засвидетельствовали высокую положительность на маркеры мезенхимальных клеток, предполагая оптимальный регенеративный потенциал.

Введение

Недавние исследования изоляции не-эмбриональных стволовых клеток обеспечивает новые возможности для не инвазивных процедур регенерации кости из стволовых клеток, собранных из аутологичных тканей. Дезагрегатор биологических тканей Regeneracons®, основанный на протоколе Regenera, позволяет извлекать микро-трансплантаты 50 микрон из образца нескольких миллиметров аутологичной соединительной ткани, непосредственно в течение операции, и немедленно использовать, без каких-либо манипуляций или клеточной культуры, как описано выше. Если поместить в культуру, чтобы проверить природу и состав микро-трансплантатов, последние показывают жизнеспособные клетки внутри них и клеточные популяции, внутри трансплантатов, особенно богаты с точки зрения клеток-предшественников. Таким образом, с помощью этого инновационного медицинского устройства под названием Regeneracons®, пациенты, в одно и то же время, являются донорами и акцепторами этих микро-трансплантатов. В настоящее время основная сфера применения протокола Regenera является орально-челюстно-лицевая хирургия и дерматология. В связи с этим, мы недавно продемонстрировали эффективность устройства Regeneracons® в получении клеток-предшественников из пульпы зуба и жировой ткани, выделенных из выбраковки фолликулярной нарезки. Кроме того, мы показали, что устройство Regeneracons® было в состоянии обеспечить аутологичные микро-трансплантаты из соединительной ткани, чтобы улучшить поколение тканей пародонта. На основании этих доказательств, мы стремились продемонстрировать In vitro способности медицинского устройства Regeneracons®, чтобы обеспечить высокий процент жизнеспособных клеток-предшественников из трех различных образцов тканей человека. Кроме того, мы также провели характеристику этих клеток-предшественников путем оценки проточной цитометрии (FACS).

Материалы и методы

Мы провели эксперименты по жизнеспособности клеток и характеристике клеток на образцах клеток надкостницы, сердечного предсердия и боковой мышцы глазного яблока. Образцы надкостницы были собраны у 3-х пациентов, которые были проинформированы в устной форме и дали письменное согласие. Все 3 пациента были подвергнуты терапевтической стоматологической авульсии и мы сделали забор образцов надкостницы из неба (1x1cm). Образцы были немедленно депонированы в стерильный флакон Фалькон и дезагрегированы в стерильных условиях (вертикальный ламинарный поток бленда) с помощью медицинского устройства Regeneracons® в течение 2-х минут. Полученную суспензию клеток культивировали и впоследствии охарактеризовали с помощью проточной цитометрии (FACS) с использованием панели антител, которые обычно используют для идентификации мезенхимных клеток, в том числе CD90, CD105, CD73, CD45, CD14, в дополнение к окрашиванию 7AAD для того, чтобы измерить жизнеспособности клеток. Мы также получили предварительные данные о жизнеспособности клеток в сердечных клетках, полученных из 20 различных образцов биопсии предсердия и прямой мышцы глазного яблока у 3-х различных пациентов, страдающих косоглазием. Жизнеспособность клеток, полученных из биопсии предсердия измеряли с помощью автоматического подсчета клеток с использованием трипанового синего, окрашивая их, после механической дезагрегации при помощи Regeneracons®, в то время как жизнеспособность клеток, полученных путем дезагрегации латеральной прямой мышцы оценивали с помощью анализа проточной цитометрии (FACS) с использованием пропидиума йодида (PI) для маркерных клеток.

Результаты

После обработки проб надкостницы, мы наблюдали появление первых клеточных колоний после 15- 20 дней. Через месяц после посева, эти клеточные колонии были отделены от пластины и вновь посеяны, и клетки анализировались с помощью конфокальной микроскопии и проточной цитометрии. Как показано на рис. 1, мы подтвердили наличие 2 различных популяций клеток, одна продолговатой формы и один ромбовидной формы, более крупная. Впоследствии мы охарактеризовали популяцию клеток в два различных этапа: сразу после обработки проб и спустя месяц, когда пересевали клеточные колонии. Клеточная характеристика была выполнена проточной цитометрией (FACS) и мы сообщили о том, что, кажется, полученные клетки принадлежат к мезенхимальной линии, что показано позитивностью нескольких маркеров мезенхимальных клеток, в том числе CD90 (52%), CD105 (82%) и CD73 (82%) (рис. 2A панели а — с). Мы также наблюдали, что эти клетки были отрицательными для CD45 (рис. 2 панель d) и CD14 (рис. 2А панель е). Кроме того, окрашивая клетки 7AAD маркером, мы наблюдали, что жизнеспособность клеток составляла 73% (рис. 2, панель f). Аналогичные результаты были получены, когда клетки были отделены и пересеяны (рис. 2B панели g — l). Таким образом, эти данные указывают на то, что эти клетки являются положительными для линии маркеров мезенхимальных клеток и отрицательными для кроветворных маркеров и маркеров макрофагов.

В дополнение к этим данным, мы провели предварительные эксперименты жизнеспособности клеток в различных образцах тканей предсердия, дезагрегированных при помощи устройства Regeneracons®. Кроме того, в этом случае было обнаружено, что жизнеспособность клеток полученной суспензии была 96-100% (данные не показаны). Лишь в одном случае, жизнеспособность клеток была 53%, вероятно, из-за того, что ткани не были обработаны сразу после диссекции у пациента. Интересные данные, что при комнатной температуре жизнеспособность клеток была более чем 90%, даже через 4 часа (данные не показаны). И, наконец, мы провели очень предварительные эксперименты на 3-х образцах латеральной прямой мышцы глазного яблока, обработанного устройством Regeneracons®, и по наблюдениям, жизнеспособности клеток были 97, 76 и 56%, соответственно (рис. 3).

Обсуждение

В данном исследовании мы сообщили наши предварительные in vitro данные о жизнеспособности клеток и клеточной характеристике клеток-предшественников, полученных с помощью нового медицинского устройства под названием Regeneracons®. Мы фактически показали, что микрографты, полученные из образцов надкостницы обогащены клетками-предшественниками, поддерживающими способность дифференцироваться. На самом деле, клеточная характеристика, в исполнении проточной цитометрии (FACS) показала, что эти микро-трансплантаты богаты мезенхимальными стволовыми клетками, которые на сегодняшний день в основном исследуются в области регенерации тканей благодаря нескольким их биологическим свойствам. В соответствии с этими результатами, Занзоттера и др. показали, что процент чистых клеток-предшественников (мезенхимальных стволовых клеток) был 15% и 17% в образцах, полученных из выборки фолликулярной нарезки по отношению к 2%, обычно отмечающимся литературе. Кроме того, в той же статье сообщается о высоком присутствии эндотелиальных клеток и перицитов (Занзоттера и др., 2014), которые, в свою очередь, играют существенную роль в регенерации тканей, способствуя посттравматической реваскуляризации.

Очевидно, что высокая жизнеспособность является ключевым фактором в регенерации ткани с целью восстановления правильной анатомии и функциональности. Выделение клеток часто сложно и методы экстракции, такие как ферментативное расщепление или механическая дезагрегация, требуют времени, от нескольких минут до нескольких часов, и это может уменьшить их жизнеспособность. Устройство Regeneracons® производит клеточную суспензию в течение нескольких минут (около 2), содержащую миллионы жизнеспособных клеток с отсечкой 50 мкм, своевременно выбранных путем фильтрации. С этой целью, в данном докладе мы показали, что процент жизнеспособных клеток, полученных из образцов надкостницы, был очень высоким, предполагая, что устройство Rigeneracons® обеспечивает оптимальную и эффективную процедуру экстракции. Эти данные находятся в соответствии с нашими предыдущими данными, по образцам дермы, где мы обнаружили, что жизнеспособность клеток была 93% и 73% (Занзоттера и др., 2014). Оптимальные результаты по выживаемости клеток также наблюдались в образцах биопсии предсердия и латеральной прямой мышцы глазного яблока. Клиническая эффективность микро-трансплантатов, созданных устройством Regeneracons®, была также продемонстрирована в нашей самой последней работе, где мы сообщали о мелиорации лечения и заживления сложных ран у двух различных пациентов (Джакконе и др., 2014).

Вместе с доказательствами in vitro, это новое медицинское устройство обеспечивает другие преимущества, такие как легкость и безопасность использования протокола Regenera во время оперативного вмешательства, как в самой операционной, так и при амбулаторном лечении. Кроме того, с использованием протокола Regenera, донор и акцептор один и тот же, что предотвращает возможные осложнения, связанные с не аутологичными микро-трансплантатами. Протокол Regenera в настоящее время используется в орально-челюстно-лицевой области, как показали недавние исследования (Брунелли и др 2013;. Грациано и др 2013.) и в дерматологии (Занзоттера и др 2014;. Джакконе и др 2014. ), но он может потенциально использоваться и в других клинических областях, включая пластическую хирургию и ортопедию.

В заключение, мы сообщили о высокой эффективности устройства Regeneracons®, для изготовления суспензии клеток-предшественников из различных тканей человека, с высоким процентом жизнеспособности. Кроме того, мы сообщили, что образцы, полученные из надкостницы также имеют хороший процент мезенхимальных клеток, которые способны дифференцироваться в другом типе клеток и улучшают регенерацию тканей.

Рисунки

Рисунок 1 (А-С). Изображения клеточной культуры, полученные из образца надкостницы после дезагрегации устройством Regeneracons®. Клетки были сняты при помощи конфокальной микроскопии при различном увеличении (Х10, Х21, Х30). (D-F). Ядра окрашивали 2 мкг/мл 4 ‘, 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI).
Рисунок 2. Жизнеспособность и характеристика клеток, выделенных из надкостницы. (А) оценка проточной цитометрией (FACS) одного образца надкостницы сразу после того, как он был культивирован дезагрегацией при помощи устройства Rigeneracons®. (B) оценка проточной цитометрией (FACS) того же образца, спустя месяц после культивации и после того, как он был пересеян. Клеточная характеристика проводилась с использованием маркеров мезенхимальных клеточной линии, таких как CD90, CD105 и CD73. CD45 является маркером миелоидного происхождения и CD14 является маркером макрофага. Жизнеспособность клеток оценивали с помощью 7AAD окрашивания.
Рисунок 3. Жизнеспособность клетки, выделенной из латеральной прямой мышцы глазного яблока. Изображение – это выборка 3-х образцов, проанализированных и дезагрегированных при помощи утсройства Regeneracons®. Жизнеспособность клеток оценивали с помощью анализа проточной цитометрии (FACS) с использованием пропидиума йодида для окрашивания клеток.