0800 211 530 безкоштовно в межах України
Українa, м. Одеса, вул. Базарна, 27
Зв'язатися з нами

Клінічна ефективність мікротрансплантатів

Новий медичний пристрій Regeneracons дозволяє отримати життєздатні мікротрансплантати за допомогою механічної дезагрегації людських тканин. Висока ефективність пристрою Regeneracons® для виготовлення суспензії клітин-попередників з різних тканин людини з високим відсотком життєздатності.

Анотація

Аутологічний трансплантат вважається золотим стандартом трансплантаційних матеріалів, проте цей підхід все ще обмежений через невелику кількість тканини, яка може бути зібрана, і через зниження життєздатності клітин, які можуть бути отримані. Мета цього попереднього дослідження полягала в тому, щоб продемонструвати ефективність інноваційного медичного пристрою під назвою Regeneracons® (CE сертифікований клас I), щоб зробити аутогенні мікротрансплантати негайно доступними для використання у клінічній практиці. Крім того, Regeneracons® є інструментом, здатним створити мікротрансплантати, збагачені клітинами попередниками, які підтримують їх регенеративний та диференціативний потенціал. Ми навели попередні дані про життєздатність клітин у пробах, отриманих з різних видів тканин людини, таких як окістя, біопсія серцевого передсердя та прямий м’яз очного яблука, дезагрегованих за допомогою Regeneracons®. У всіх випадках ми спостерігали, що мікротрансплантати, отримані Regeneracons® виявили високу життєздатність клітин. Крім того, за допомогою клітинної характеристики зразків окістя ми також засвідчили високу позитивність на маркери мезенхімальних клітин, припускаючи оптимальний регенеративний потенціал.

Вступ

Недавні дослідження ізоляції неембріональних стовбурових клітин забезпечує нові можливості для неінвазивних процедур регенерації кістки зі стовбурових клітин, зібраних з аутологічних тканин. Дезагрегатор біологічних тканин Regeneracons®, заснований на протоколі Regenera, дозволяє витягувати мікротрансплантати 50 мікрон із зразка кількох міліметрів аутологічної сполучної тканини, безпосередньо протягом операції, і негайно використовувати без будь-яких маніпуляцій або клітинної культури, як описано вище. Якщо помістити в культуру, щоб перевірити природу і склад мікротрансплантатів, останні показують життєздатні клітини всередині них і клітинні популяції, всередині трансплантатів, особливо багаті з погляду клітин-попередників. Таким чином, за допомогою цього інноваційного медичного пристрою під назвою Regeneracons®, пацієнти, водночас, є донорами та акцепторами цих мікротрансплантатів. В даний час основною сферою застосування протоколу Regenera є орально-щелепно-лицьова хірургія та дерматологія. У зв’язку з цим ми недавно продемонстрували ефективність пристрою Regeneracons® в отриманні клітин-попередників з пульпи зуба та жирової тканини, виділених з вибракування фолікулярної нарізки. Крім того, ми показали, що пристрій Regeneracons® міг забезпечити аутологічні мікротрансплантати зі сполучної тканини, щоб поліпшити покоління тканин пародонту. На підставі цих доказів, ми прагнули продемонструвати In vitro здібності медичного пристрою Regeneracons®, щоб забезпечити високий відсоток життєздатних клітин-попередників із трьох різних зразків тканин людини. Крім того, ми також провели характеристику цих клітин попередників шляхом оцінки проточної цитометрії (FACS).

Матеріали та методи

Ми провели експерименти по життєздатності клітин і характеристиці клітин на зразках клітин окістя, серцевого передсердя і бічний м’язи очного яблука. Зразки окістя були зібрані у 3-х пацієнтів, які були проінформовані в усній формі і дали письмову згоду. Всі 3 пацієнта були піддані терапевтичної стоматологічної авульсіей і ми зробили забір зразків окістя з неба (1x1cm). Зразки були негайно депоновані в стерильний флакон Фалькон і дезагреговані в стерильних умовах (вертикальний ламінарний потік бленда) за допомогою медичного пристрою Regeneracons® протягом 2-х хвилин. Отриману суспензію клітин культивували і згодом охарактеризували за допомогою проточної цитометрії (FACS) з використанням панелі антитіл, які зазвичай використовують для ідентифікації мезенхімних клітин, в тому числі CD90, CD105, CD73, CD45, CD14, на додаток до фарбування 7AAD для того, щоб виміряти життєздатності клітин. Ми також отримали попередні дані про життєздатність клітин в серцевих клітинах, отриманих з 20 різних зразків біопсії передсердя і прямого м’яза очного яблука у 3-х різних пацієнтів, які страждають косоокістю. Життєздатність клітин, отриманих з біопсії передсердя вимірювали за допомогою автоматичного підрахунку клітин з використанням трипанового синього, фарбуючи їх, після механічної дезагрегації за допомогою Regeneracons®, в той час як життєздатність клітин, отриманих шляхом дезагрегації латеральної прямого м’яза оцінювали за допомогою аналізу проточної цитометрії (FACS ) з використанням пропідіума йодиду (PI) для маркерних клітин.

Результати

Після обробки проб окістя, ми спостерігали появу перших клітинних колоній після 15- 20 днів. Через місяць після посіву, ці клітинні колонії були відокремлені від пластини і знову посіяні, і клітини аналізувалися за допомогою конфокальної мікроскопії та проточної цитометрії. Як показано на мал. 1, ми підтвердили наявність 2 різних популяцій клітин, одна довгастої форми і один ромбовидної форми, більша. Згодом ми охарактеризували популяцію клітин в два різних етапи: відразу після обробки проб і через місяць, коли пересівали клітинні колонії. Клітинна характеристика була виконана проточної цитометрії (FACS) і ми повідомили про те, що, здається, отримані клітини належать до мезенхимальной лінії, що показано позитивністю декількох маркерів мезенхімальних клітин, в тому числі CD90 (52%), CD105 (82%) і CD73 (82%) (мал. 2A панелі а – с). Ми також спостерігали, що ці клітини були негативними для CD45 (мал. 2 панель d) і CD14 (мал. 2А панель е). Крім того, фарбуючи клітини 7AAD маркером, ми спостерігали, що життєздатність клітин становила 73% (мал. 2, панель f). Аналогічні результати були отримані, коли клітини були відділені і пересіяно (рис. 2B панелі g – l). Таким чином, ці дані вказують на те, що ці клітини є позитивними для лінії маркерів мезенхімальних клітин і негативними для кровотворних маркерів і маркерів макрофагів.

На додаток до цих даних, ми провели попередні експерименти життєздатності клітин в різних зразках тканин передсердя, дезагреговані за допомогою пристрою Regeneracons®. Крім того, в цьому випадку було виявлено, що життєздатність клітин отриманої суспензії була 96-100% (дані не показані). Лише в одному випадку, життєздатність клітин була 53%, ймовірно, через те, що тканини не були оброблені відразу після диссекции у пацієнта. Цікаві дані, що при кімнатній температурі життєздатність клітин була більш ніж 90%, навіть через 4 години (дані не показані). І, нарешті, ми провели дуже попередні експерименти на 3-х зразках латеральної прямого м’яза очного яблука, обробленого пристроєм Regeneracons®, і за спостереженнями, життєздатності клітин були 97, 76 і 56%, відповідно (мал. 3).

Обговорення

В даному дослідженні ми повідомили наші попередні in vitro дані про життєздатність клітин і клітинної характеристиці клітин-попередників, отриманих за допомогою нового медичного пристрою під назвою Regeneracons®. Ми фактично показали, що мікрографти, отримані зі зразків окістя збагачені клітинами-попередниками, що підтримують здатність диференціюватися. Насправді, клітинна характеристика, у виконанні проточної цитометрії (FACS) показала, що ці мікро-трансплантати багаті мезенхімальних стовбуровими клітинами, які на сьогоднішній день в основному досліджуються в області регенерації тканин завдяки кільком їхнім біологічним властивостям. Відповідно до цих результатами, Занзоттера і ін. Показали, що відсоток чистих клітин-попередників (мезенхімальних стовбурових клітин) був 15% і 17% в зразках, отриманих з вибірки фолікулярної нарізки по відношенню до 2%, зазвичай святкується літературі. Крім того, в тій же статті повідомляється про високий присутності ендотеліальних клітин і перицитів (Занзоттера і ін., 2014 року), які, в свою чергу, грають істотну роль в регенерації тканин, сприяючи посттравматической реваскуляризації.

Очевидно, що висока життєздатність є ключовим фактором в регенерації тканини з метою відновлення правильної анатомії і функціональності. Виділення клітин часто складно і методи екстракції, такі як ферментативне розщеплення або механічна дезагрегації, вимагають часу, від декількох хвилин до декількох годин, і це може зменшити їх життєздатність. Пристрій Regeneracons® виробляє клітинну суспензію протягом декількох хвилин (близько 2), що містить мільйони життєздатних клітин з відсіченням 50 мкм, своєчасно обраних шляхом фільтрації. З цією метою, в даному доповіді ми показали, що відсоток життєздатних клітин, отриманих із зразків окістя, був дуже високим, припускаючи, що пристрій Rigeneracons® забезпечує оптимальну і ефективну процедуру екстракції. Ці дані знаходяться у відповідності з нашими попередніми даними, за зразками дерми, де ми виявили, що життєздатність клітин була 93% і 73% (Занзоттера і ін., 2014 року). Оптимальні результати по виживаності клітин також спостерігалися в зразках біопсії передсердя і латеральної прямого м’яза очного яблука. Клінічна ефективність мікро-трансплантатів, створених пристроєм Regeneracons®, була також продемонстрована в нашій самої останній роботі, де ми повідомляли про меліорації лікування і загоєння складних ран у двох різних пацієнтів (Джакконі і ін., 2014 року).

Разом з доказами in vitro, це нове медичне пристрій забезпечує інші переваги, такі як легкість і безпеку використання протоколу Regenera під час оперативного втручання, як в самій операційній, так і при амбулаторному лікуванні. Крім того, з використанням протоколу Regenera, донор і акцептор один і той же, що запобігає можливим ускладненням, пов’язані з не аутологічними мікро-трансплантатами. Протокол Regenera в даний час використовується в орально-щелепно-лицевої ділянки, як показали недавні дослідження (Брунеллі і ін 2013 ;. Граціано і ін 2013.) і в дерматології (Занзоттера і ін 2014 ;. Джакконі і ін 2014.), але він може потенційно використовуватися і в інших клінічних областях, включаючи пластичну хірургію і ортопедію.

На закінчення, ми повідомили про високу ефективність пристрою Regeneracons®, для виготовлення суспензії клітин-попередників з різних тканин людини, з високим відсотком життєздатності. Крім того, ми повідомили, що зразки, отримані з окісті також мають хороший відсоток мезенхімальних клітин, які здатні диференціюватися в іншому типі клітин і покращують регенерацію тканин.

Малюнки

Малюнок 1 (А-С). Зображення клітинної культури, отримані з зразка окістя після дезагрегации пристроєм Regeneracons®. Клітини були зняті за допомогою конфокальної мікроскопії при різному збільшенні (Х10, Х21, Х30). (D-F). Ядра фарбували 2 мкг / мл 4 ‘, 6-діамідинів-2-феніліндола (DAPI).
Малюнок 2. Життєздатність та характеристика клітин, виділених з окістя. (А) оцінка проточної цитометрії (FACS) одного зразка окістя відразу після того, як він був культивований дезагрегація за допомогою пристрою Rigeneracons®. (B) оцінка проточної цитометрії (FACS) того ж зразка, через місяць після культивації і після того, як він був пересіян. Клітинна характеристика проводилася з використанням маркерів мезенхімальних клітинних ліній, таких як CD90, CD105 і CD73. CD45 є маркером миелоидного походження і CD14 є маркером макрофаги. Життєздатність клітин оцінювали за допомогою 7AAD фарбування.
Малюнок 3. Життєздатність клітини, виділений з латеральної прямої м’язи очного яблука. Зображення – це вибірка 3-х зразків, проаналізованих і дезагреговані за допомогою утсройство Regeneracons®. Життєздатність клітин оцінювали за допомогою аналізу проточної цитометрії (FACS) з використанням пропідіума йодиду для фарбування клітин.